После смерти Франческо I в 1587 году его брат Фердинандо оставил духовную карьеру, чтобы принять управление государствам в свои руки. Культурные интересы Фердинандо были ориентированы на науки и научные тенденции, которые появились к концу столетия. Фердинандо Первый также интересовался Галереей, и он обогатил ее рядом “Джована”, дополнил коллекцию портретов известных личностей, которую начал собирает еще его отец, Козимо I.

Он тогда также имеет отношение к созданию комнаты для “Географических Карт”, для декора которой он пригласил Людовико Бути, который в свою очередь создан настенные фрески с картами “Старой Флоренции”, “Сиены” и “Острова Эльбы”. В центре зала располагался глобус и армиллярная сфера, в то время как несколько сеток, нарисованных Якопо Цукки на мифологических сюжетах, удаленных из римской виллы Великого Герцога, располагались на потолке.

В небольшой комнате рядом с Трибуной располагались приборы для исследований, как иллюстрировано на потолочных фресках, на которых показаны математические числа и сцены с изобретениями Архимеда. По инициативе великого герцога Фердинандо I в Уффици появились мастерские и мануфактуры ювелиров, скульпторов, садовников, живописцев и мастеров по фарфору и керамике.

Предметы роскоши, созданные в этих мастерских, использовались в качестве подарков по случаю свадеб, рождений и других празднований, сделали флорентийских мастеров известными во всем мире. Некоторые из этих предметов демонстрируются в Музее Ардженти. Чтобы обеспечить доступ к мастерским, была построена лестница с западного фланга, и известна как лестница Буонталенти. Между Трибуной и Арно располагается семь залов, в которых располагалась коллекция вооружения и военной техники, от которой сохранилось всего несколько экспонатов, которые теперь выставляются в Национальном музее Барджелло.

Потолки были украшены Людовико Бути в 1588 году фресками, некоторые из которых были позже переделаны. Залы заканчивались залом, в котором размещалась глиптотека, принесенная как приданое женой Великого Герцога, Кристиной Лотарингской, а в настоящее время в ней располагается коллекция миниатюр. После смерти Фердинандо I в 1609 году, Галерея оставалась неизменной в течение почти половины столетия.